Microencapsulatie van eilandjes van Langerhans is een reeds veel bestudeerde
mogelijkheid die transplantatie van eilandjes zonder immunosuppressie
mogelijk maakt door ze te verpakken in kleine semi-permeabele microkapsels.
Deze microkapsels zijn wel doorlaatbaar voor kleine stoffen zoals insuline en
glucose, maar niet voor de veel grotere antilichamen en cellen van het
immuunsysteem. De semi-permeabele membraan werkt als een mechanische
barrière die het ook mogelijk kan maken cellen van dierlijke afkomst te
transplanteren. Microencapsulatie is dus niet alleen een alternatief voor
immunosuppressie, maar zou ook kunnen bijdragen aan het oplossen van het
donortekort. In dit proefschrift wordt nader in gegaan op immunoprotectie van
pancreaseilandjes door middel van microencapsulatie.
Microkapsels bestaan uit een matrix van alginaat, met een doorsnede van
circa 750 μm, bedekt met poly-L-lysine voor het aanbrengen van de semipermeabele
eigenschappen. Alginaat-poly-L-lysine microkapsels werden voor het
eerst met succes toegepast bij diabetische ratten door Lim en Sun in 1980. Zij
hebben geëncapsuleerde eilandjes naar de buikholte getransplanteerd en
bereikten daarmee, gedurende 2-3 weken, normoglycemie zonder immunosuppressie.
Deze microencapsulatie-techniek is sindsdien op veel fronten
verbeterd, maar de transplantaatoverleving in proefdieren blijft nog beperkt tot
perioden van drie tot zes maanden. Dit is te kort om deze behandeling toe te
passen bij patiënten. Om de transplantaatoverleving te verlengen is meer inzicht
nodig in de oorzaken van de beperkte overlevingsduur. Daarom is het onderwerp
van dit proefschrift onderzoek naar de oorzaken van het falen van het
geëncapsuleerde eilandjestransplantaat.
HOOFDSTUK 1 behandelt de literatuur over microencapsulatie en bespreekt
de mogelijkheden en de belangrijkste knelpunten van transplantatie van geëncapsuleerde
eilandjes van Langerhans. Drie belangrijke oorzaken die bijdragen
aan falen van het transplantaat worden onderscheiden. De eerste oorzaak heeft
te maken met de poriegrootte van de semi-permeabele membraan. De poriën,
die groot genoeg zijn voor insuline en afvalstoffen, laten waarschijnlijk ook kleine
toxische verbindingen door zoals sommige cytokines en radicalen. Deze stoffen
zijn schadelijk voor eilandjes. De tweede oorzaak heeft betrekking op de
biocompatibiliteit van de geëncapsuleerde eilandjes. Deze is onvolledig waardoor
een deel van het transplantaat overgroeid wordt door macrofagen en fibroblasten.
De derde oorzaak is de lage zuurstofspanning (hypoxie) in de kapsels als gevolg
van afwezige bloedvatvoorziening. Het is niet bekend in welke mate beperkingen
van de semi-permeabele membraan, overgroei van geëncapsuleerde eilandjes,
en hypoxie binnen het kapsel elk een bijdrage leveren.
128
Diabetes Mellitus, ofwel suikerziekte, is een stofwisselingsziekte die wordt
veroorzaakt door een absoluut of een relatief tekort aan het hormoon insuline.
Insuline is verantwoordelijk voor de opslag van glucose in het lichaam. Door het
tekort aan insuline kan glucose niet meer door cellen worden opgeslagen en
blijft het in het bloed circuleren (hyperglycemie), waardoor op termijn bloedvaten
en zenuwen worden aangetast. In circa 85% van de gevallen wordt de diabetes
gekarakteriseerd door een relatief tekort aan insuline. Het relatieve tekort
betekent dat de aanmaak van insuline onvoldoende is of, zoals in de meerderheid
van de gevallen, dat de lichaamscellen ongevoelig zijn geworden voor insuline.
In deze gevallen spreekt men van diabetes type 2. Traditioneel werd dit type
ouderdomsdiabetes genoemd, maar deze benaming is in feite niet meer correct
omdat een relatief tekort aan insuline steeds vaker op jonge leeftijd wordt
aangetroffen. Het Diabetes Fonds Nederland schat het totaal aantal personen
met diabetes op 840.000. Bij ongeveer de helft van dit aantal mensen is de
diabetes niet bekend bij de huisarts of bij de patiënt zelf. Oorzaak hiervan is dat
het relatieve insulinetekort niet altijd gepaard gaat met duidelijke klachten. Bij
de overige 15% van alle mensen met diabetes wordt de ziekte gekarakteriseerd
door een absoluut tekort aan insuline. Meestal is dit het gevolg van een afwijkende
afweerreactie (auto-immuunreactie) die leidt tot de volledige vernietiging van
insuline producerende cellen. In Nederland lijden meer dan 68.000 mensen aan
deze vorm van diabetes, die diabetes type 1 wordt genoemd.
De afwezigheid van insuline leidt tot ernstige hyperglycemie. Het teveel
aan glucose in het bloed verlaat het lichaam via de urine, wat gepaard met
overmatige urineproductie, hevige dorst en gewichtsverlies. Het lichaam gaat
vet en spieren verbranden om het glucoseverlies te compenseren, waardoor type
1 diabeten verder afvallen en waardoor grote hoeveelheden zuren (ketonen)
vrijkomen. De patiënt kan als gevolg hiervan in een diabetisch coma geraken en
zonder behandeling aan de gevolgen van verzuring (acute ketoacidose) overlijden.
Diabetes type 1 wordt behandeld door toediening van insuline door middel van
injecties. Dankzij insuline kunnen de meeste mensen met diabetes type 1 de
bloedsuikerspiegel zelfstandig afdoende reguleren. Echter, insuline-injecties
kunnen de glucose huishouding niet volledig herstellen en zij kunnen daardoor
de ontwikkeling van aandoeningen aan ogen, nieren, zenuwen en bloedvaten
niet volledig voorkomen. De gemiddelde levensverwachting van mensen met
type 1 diabetes ligt ondanks insuline therapie ongeveer vijftien jaar lager dan die
van de bevolking in zijn geheel.
Een klein aantal mensen met type 1 diabetes komt in aanmerking voor een
andere behandeling dan insuline-injecties. Insuline wordt geproduceerd door de
betacellen van de eilandjes van Langerhans, die verspreid liggen in de alvleesklier
(pancreas). Het alternatief voor insuline-injecties is het transplanteren van deze
insuline-producerende cellen.
Dat wordt meestal gedaan door de gehele pancreas
te transplanteren, maar het is ook mogelijk om alleen de eilandjes van Langerhans
te transplanteren. Na een geslaagde transplantatie kan het getransplanteerde
weefsel de glucosehuishouding beter handhaven dan insuline toegediend middels
injecties. Succesvolle pancreastransplantatie zorgt voor een volledig herstel van
de regulatie van de bloedsuikerspiegel, voorkomt op deze wijze de ontwikkeling
van diabetische complicaties en kan bestaande complicaties soms zelfs genezen.
Transplantatie kent echter ook een paar nadelen. Een nadeel is dat een
pancreastransplantatie een grote operatie verreist, wat risico’s voor de patiënt
met zich meebrengt. Wat dit betreft is transplantatie van eilandjes aantrekkelijker.
De pancreas bevat 1 tot 2 miljoen eilandjes van Langerhans die bij elkaar minder
dan 2% van het totale volume van de pancreas in beslag nemen. Dit geringe
volume heeft als voordeel dat de transplantatie slechts een bescheiden ingreep
vergt met minimaal risico voor de patiënt, die in feite neerkomt op een wat
ingewikkelde injectie of infusie.
Bijkomend voordeel is dat eilandjesweefsel gemakkelijker dan een gehele pancreas voorafgaand aan de transplantatie bepaalde behandelingen kan ondergaan, bijvoorbeeld om de kans op afstoting te verkleinen.
Eilandjestransplantatie kent dus voordelen ten opzichte van pancreastransplantatie.
Echter, de isolatieprocedure voorafgaand aan implantatie is
gecompliceerd en pas sinds een aantal jaren effectief genoeg om eilandjestransplantatie
met succes bij patiënten toe te passen. Helaas zijn er nog meer
dan twee pancreassen nodig om voldoende eilandjes te verkrijgen voor één
transplantatie. Dit is duidelijk een beperking van eilandjestransplantatie gezien
het wereldwijde tekort aan donoren.
Er zit nog een groot nadeel aan zowel pancreastransplantatie als eilandjestransplantatie.
Beide vormen van transplantatie hebben levenslang immunosuppressieve
medicatie nodig om afstoting te voorkomen. Deze middelen gaan
gepaard met een verhoogd risico op infectie en op het ontwikkelen van tumoren.
Transplantatie wordt daarom meestal alleen uitgevoerd bij patiënten die als gevolg
van nierfalen in aanmerking komen voor een niertransplantatie. De niertransplantatie
kan dan evengoed gecombineerd worden met een pancreas- of
eilandjestransplantatie, want de patiënt krijgt toch al immunosuppressieve
medicatie om afstoting van de getransplanteerde nier te voorkomen. Naar
gangbaar inzicht wegen de bijwerkingen van immunosuppressie voor de meeste
mensen met diabetesniet op tegen de nadelen van insuline therapie. Transplantatie
kan insulinetherapie pas op grote schaal vervangen wanneer hij kan worden
uitgevoerd met minder nadelige neveneffecten. Daarom wordt onderzoek verricht
naar methoden die transplantatie zonder immunosuppressie mogelijk maken.
HOOFDSTUK 2 beschrijft de opbouw van het proefschrift en geeft de reden
voor het onderzoek. De reden is het vergroten van inzicht in de drie belangrijke
oorzaken van transplantaatfalen met als doel een betere transplantatiestrategie
te kunnen definiëren. In HOOFDSTUK 3 wordt onderzoek beschreven naar de
mogelijkheden de bescherming van eilandjes door microkapsels te verbeteren
door de semi-permeabiliteit van de kapsels te moduleren. Om analyse van
geëncapsuleerde eilandjes op moleculair niveau middels RT-PCR (Reverse
Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) mogelijk te maken werd een methode
ontwikkeld die kapsels van eilandjes verwijdert zonder de eilandjes te
beschadigen. Deze methode staat beschreven in HOOFDSTUK 4. Een onderzoek
naar het effect van overgroei op naburige geëncapsuleerde eilandjes staat
beschreven in HOOFDSTUK 5, en een onderzoek naar de reactie van geëncapsuleerde
eilandjes op hypoxie in HOOFDSTUK 6. In HOOFDSTUK 7 worden de resultaten uit
de afzonderlijke hoofdstukken samengevat en bediscussieerd.
De poriegrootte van de semi-permeabele membraan van kapsels hangt af
van onder andere de incubatietijd van alginaatdruppels met poly-L-lysine (PLL)
tijdens de encapsulatie procedure. Hoe langer de incubatie met PLL, des te kleiner
zijn de poriën. HOOFDSTUK 3 beschrijft een onderzoek naar de diffusie van insuline
(6 kDa), Il-1β (17.5 kDa) en TNF-α (51 kDa) bij vier verschillende typen kapsels
waarbij de poriegrootte werd gevarieerd door tijdens de encapsulatieprocedure
gedurende respectievelijk 5, 10, 15, en 20 minuten te incuberen met PLL. Deze
kapsels zijn ook getest op hun vermogen eilandjes te beschermen tegen de
cytokines Il-1β en TNF-α. Uit dit onderzoek blijkt dat microkapsels, waarbij
tijdens de encapsulatieprocedure gedurende 10 minuten met PLL werd
geïncubeerd (10 min PLL), reeds met bijna 98% de diffusie van cytokines
verhinderen terwijl de insulinesecretie behouden blijft. Na twee dagen kweken
in de aanwezigheid van cytokines is de insulinesecretie door eilandjes in 10 min
PLL kapsels significant hoger dan de insulinesecretie door eilandjes in 5 min
PLL kapsels. Diffusie van cytokines is nog verder verlaagd in 15 min PLL, maar
deze verlaging gaat gepaard met een reductie van de insulinesecretie. De 15 min
PLL kapsels leveren dus uiteindelijk geen voordeel op. We kunnen concluderen
dat microkapsels bescherming kunnen bieden tegen cytokines en dat de mate
van bescherming verbeterd kan worden zonder dat dit ten koste gaat van de
insulinesecretie. De optimale balans tussen bescherming en functiebehoud wordt
bereikt door kapsels tijdens de encapsulatieprocedure gedurende tien minuten
in PLL te incuberen.
Analyse van genexpressie middels RT-PCR maakt het mogelijk te bepalen
hoe cellen reageren op specifieke omstandigheden. Zo kan bijvoorbeeld gekeken
worden naar de expressie van het anti-apoptotische gen Bcl-2 of het pro132
apoptotische gen Bax om te bepalen of cellen onder fysische of chemische stress
neiging tot apoptose vertonen of juist niet. Genen waarvan de expressie beïnvloed
wordt door Il-1β zijn bijvoorbeeld het gen voor induceerbare stikstofoxide
synthase enzym (iNOS) en het gen voor Monocyte Chemoattractant Protein 1
(MCP-1). Analyse van genexpressie middels RT-PCR bleek niet mogelijk te zijn
op geëncapsuleerde eilandjes omdat PLL interfereert met zowel met cDNA
synthese als met de PCR amplificatie. Daarom is een methode ontwikkeld die
het mogelijk maakt eilandjes uit kapsels te verwijderen zonder dat de eilandjes
worden beschadigd. Deze methode, waardoor RT-PCR van geëncapsuleerde
eilandjes mogelijk wordt, staat in HOOFDSTUK 4 beschreven. De vitaliteit en de
gestimuleerde insuline secretie veranderd niet door deze ontkapselingmethode,
en genexpressie van niet geëncapsuleerde eilandjes en van ontkapselde eilandjes
blijft gelijk voor wat betreft een viertal genen (Bcl-2, Bax, GAPDH en β-actine).
Ontkapseling is in de volgende twee hoofdstukken toegepast om het mogelijk te
maken genexpressie te analyseren.
Macrofagen zijn een belangrijke oorzakelijk factor bij het falen van
transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes. Ongeveer 40% van het
oorspronkelijk aantal getransplanteerde eilandjes gaat verloren doordat kapsels
overgroeid raken met macrofagen en fibroblasten. Een deel daarvan (10-15%)
kan worden verklaard door onregelmatigheden aan de oppervlakte van de kapsels,
waardoor de kapsels als lichaamsvreemd (niet biocompatibel) worden gezien. In
de meeste gevallen (circa 10%) wordt deze onregelmatigheid veroorzaakt doordat
het eilandje niet in het midden, maar aan de rand van het kapsel zit. Het verlies
van eilandjes door overgroei is aanzienlijk, maar niet onoverkomelijk zolang de
rest van het transplantaat goed blijft functioneren. Maar de bijdrage van
macrofagen aan het falen van het transplantaat blijft waarschijnlijk niet beperkt
tot de overgroei van kapsels. Macrofagen produceren toxische stoffen zoals Il-
1β, TNF-α en stikstof oxide (NO), waarvan is aangetoond dat ze de functie en
de vitaliteit van eilandjes kunnen aantasten indien ze het kapsel passeren. In
HOOFDSTUK 5 is onderzocht of macrofagen op overgroeide kapsels naburige nietovergroeide
geëncapsuleerde eilandjes nadelig beïnvloeden. Hiertoe werden vers
geëncapsuleerde eilandjes gedurende twee dagen in kweek gebracht met door
macrofagen overgroeide kapsels (coculture). Deze overgroeide kapsels werden
geïsoleerd uit de buikholte van een rat met diabetes, drie weken na transplantatie
van geëncapsuleerde eilandjes. De resultaten uit dit onderzoek leiden tot twee
belangrijke bevindingen. Ten eerste blijkt dat macrofagen op overgroeide kapsels
inderdaad de functie en vitaliteit van naburige geëncapsuleerde eilandjes schaden.
Ten tweede blijkt dat deze schade niet zozeer bewerkstelligd wordt door cytokines,
maar door NO. Deze bevinding is in overeenstemming met de resultaten uit
SAMENVATTING 133
hoofdstuk drie waaruit blijkt dat kapsels bescherming kunnen bieden tegen de
kwalijke effecten van cytokines. NO is echter een zeer klein (30 Da) en agressief
molecuul dat de semi-permeabele membraan gemakkelijk kan passeren. Deze
resultaten benadrukken het belang om overgroei tot een minimum te beperken.
Aangezien het lastig is overgroei volledig te elimineren in de macrofaagrijke
buikholte, is het gewenst encapsulatie te combineren met methoden die
additionele bescherming bieden tegen NO-toxiciteit.
Naast macrofagen draagt een lage zuurstofspanning (hypoxie) in de kapsels
bij aan het falen van het transplantaat. Deze hypoxie is het gevolg van de afwezige
bloedvatvoorziening. Om meer inzicht te krijgen in de relatie tussen zuurstoftekort
en transplantaatfalen zijn in HOOFDSTUK 6 eilandjes in vitro onderzocht onder
hypoxische omstandigheden. Er is gekozen voor een model van ernstig
zuurstoftekort (1% O2) zoals zich dat lokaal in de buikholte kan voordoen.
Hypoxie leidt tot functieverlies, tot necrose en in mindere mate tot apoptose.
Een belangrijke bevinding is dat hypoxie de genexpressie van de chemokine
Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) verhoogd. Deze verhoogde MCP-
1 expressie werd gevonden op mRNA-niveau, maar hij werd niet teruggevonden
op eiwit-niveau. De lage eiwitconcentratie is het gevolg van het feit dat door de
hypoxie minder vitale cellen aanwezig zijn die eiwitten produceren. Daarbij wordt
het MCP-1 eiwit waarschijnlijk afgebroken door lyserende enzymen, die vrijkomen
door de hoge celsterfte. Aanwijzingen uit de literatuur maken een posttranscriptionele
neerwaartse regulatie van de expressie niet aannemelijk als
verklaring van de discrepantie in expressie op mRNA- en eiwit-niveau. De
verhoogde expressie onder invloed van hypoxie kan begrepen worden als een
signaal van eilandjes om de aanmaak van nieuwe bloedvaten te stimuleren. MCP-
1 trekt macrofagen aan die onder andere een rol spelen bij neovascularisatie.
Nieuwe bloedvaten kunnen echter niet dicht bij de eilandjes komen door de
aanwezigheid van de kapsels. Door het aantrekken van macrofagen neemt de
kans op overgroei van het kapsel toe, wat een verklaring kan zijn voor de
aanwezigheid van overgroei die niet verklaard kan worden door fysische of
chemische imperfecties van de kapsels. Deze resultaten impliceren dat eilandjes
zelf een rol spelen bij het tot stand komen van transplantaatfalen. Het is dus
van groot belang het probleem van zuurstoftekort op te lossen. Dit zal niet alleen
de functie en de vitaliteit van het transplantaat verbeteren, maar kan ook bijdragen
aan een vermindering van overgroei van geëncapsuleerde eilandjes.
Eerder onderzoek in ons laboratorium liet zien dat geëncapsuleerde eilandjes
na transplantatie naar de buikholte gemiddeld tien keer vaker delen dan eilandjes
in een gezonde pancreas. Aangezien cellen een beperkte delingscapaciteit hebben
(maximaal circa 40 keer) draagt deze verhoogde celdeling bij aan de verkorte
134
overlevingsduur van het geëncapsuleerde eilandjestransplantaat. De oorzaak van
deze hoge proliferatie is vermoedelijk gerelateerd aan cytokines of aan bij necrose
vrijgekomen stoffen, maar wat de werkelijke oorzaak is, is nog niet duidelijk.
Om te achterhalen of proliferatie verhoogd wordt door cytokines-producerende
macrofagen of door bij necrose vrijgekomen stoffen, is de celdeling tijdens
coculture (HOOFDSTUK 5) en hypoxie (HOOFDSTUK 6) bepaald. Helaas geven onze
resultaten geen verklaring voor de verhoogde replicatie in geëncapsuleerde
eilandjes. Tijdens coculture was de replicatie zelfs significant verlaagd. Deze
verlaging kan verklaard worden door de aanwezigheid van stikstofoxide, waarvan
is aangetoond is dat het de replicatie remt. Hypoxie had in onze experimenten
geen effect op de mate van celdeling. Vermoedelijk is de glucoseconcentratie in
het kweekmedium te hoog geweest om een eventueel effect van hypoxie op
eilandjesreplicatie te kunnen vaststellen, want de replicatie in de controlegroep
was al hoger dan normaal.
In HOOFDSTUK 7 wordt een aantal suggesties gegeven die het succes van
transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes van Langerhans kunnen verbeteren.
Deze verbeteringen richten zich op het bieden van extra bescherming tegen
stikstofoxide en op het oplossen of verminderen van het zuurstoftekort.
Encapsulatie biedt de mogelijkheid om naast eilandjes andere celtypen te coencapsuleren
die extra bescherming zouden kunnen bieden tegen NO-toxiciteit.
Gedacht kan worden aan erytrocyten die NO wegvangen, of aan Sertoli cellen
die locaal immunosuppressieve stoffen secreteren zodat de NO-productie door
macrofagen wordt onderdrukt. Een andere benadering om extra bescherming te
bieden tegen NO-toxiciteit is eilandjescellen genetisch te modificeren zodat zij
weerstand kunnen bieden tegen een aanval van NO. Gedacht kan worden aan
het kunstmatig omhoog brengen van de expressie van het Bcl-2 gen, waarvan is
aangetoond dat verhoogde expressie schade door NO kan beperken. Een
mogelijkheid om het probleem van het zuurstoftekort op te lossen is gebruik te
maken van de zogeheten Brockmann lichaampjes. Dit zijn, net als de eilandjes
van Langerhans, insuline producerende lichaampjes van de Tilapia vis. Deze
vissen leven in warm, stilstaand en zuurstofarm water, waardoor de cellen
weerbaar zijn tegen lage zuurstofspanning. Er zijn meer redenen waarom het
gebruik van deze hypoxie-resistente lichaampjes als donormateriaal voor
transplantatie aantrekkelijk is. Tilapia vissen zijn goedkoop, gemakkelijk in grote
aantallen te kweken en Brockmann lichaampjes zijn relatief eenvoudig te isoleren.
Een belangrijk voordeel van de vis ten opzichte van andere potentiële dierlijke
donoren, zoals het varken, is het feit dat de vis fylogenetisch weinig overeenkomsten
heeft met de mens. Dit betekent dat het risico van een virale infectie
van vis naar mens veel kleiner is dan bijvoorbeeld van het varken naar de mens.
SAMENVATTING 135
Het risico een levensbedreigend virus in de menselijke populatie te introduceren
is de belangrijkste reden waarom xenotransplantatie van varkensweefsel tot op
heden niet wordt toegelaten. Een andere mogelijke oplossing voor het
zuurstoftekort is het creëren van een kunstmatige transplantatieplaats met een
nieuwe en uitgebreide bloedvoorziening. Implantatie onder zowel een
geprevasculariseerde huid als in een kunstmatig transplantatieplaats met nieuwe
bloedvaten in de buikholte is succesvol gebleken voor eilandjes zonder
microkapsels. Wellicht biedt dit mogelijkheden voor geëncapsuleerde eilandjes.
Tenslotte, microencapsulatie is een techniek die eilandjestransplantatie bij
mensen met diabetes wellicht mogelijk kan maken zonder immunosuppressie te
gebruiken. De techniek kent nog een aantal obstakels die verholpen moeten
worden voordat microencapsulatie met succes kan worden toegepast. De
tekortkomingen van de techniek kunnen verholpen worden door bijvoorbeeld
co-encapsulatie met Sertoli cellen, genetische modificatie van eilandjescellen,
het gebruiken van niet humane donoren zoals de Tilapia vis, of door een
combinatie hiervan. Bij de ideale combinatie zal transplantatie van geëncapsuleerde
eilandjes bij mensen met type 1 diabetes op een veilige manier
niet alleen tot het voorkomen van late complicaties kunnen leiden, maar tot
genezing van de aandoening zelf.
A+ A-
Om de letters groter of kleiner te maken houdt u de controltoets ingedrukt en drukt dan op + of -
