Mw. G.G.M. Pinkse
Korte samenvatting:
Sommige mensen met diabetes mellitus type 1 (suikerziekte) komen in aanmerking voor 'eilandjestransplantatie'. De insulineproducerende eilandjes van Langerhans van donoren vervangen dan de eigen eilandjes, die verloren zijn gegaan. Maar het is moeilijk om de eilandjes uit de alvleesklier te halen. Gabrëlle Pinkse beschrijft een nieuwe isolatie-methode die goede resultaten levert. Ze spoelt de alvleesklier door met kristallen ijzeroxide. Die lopen vast in de kleinste vaten in de eilandjes en dan kan ze die eilandjes eenvoudig met een magneet opvissen.
Als de eilandjes bij de isolatie loskomen van de extracellulaire eiwitten waarin ze zijn ingebed, is dat voor veel cellen het sein tot apoptose (geprogrammeerde celdood). Het helpt om er een bepaald eiwit en eiwitfragment aan toe te voegen.
Samenvatting:
Type 1 diabetes is een ziekte die wordt gekarakteriseerd door een tekort aan insuline. Insuline wordt geproduceerd door de beta cellen gelegen in de eilandjes van Langerhans, die zich weer bevinden in de pancreas. Patiënten met type 1 diabetes moeten zichzelf hun gehele leven insuline toedienen. Door deze injecties tracht men de bloedsuikerspiegel constant te houden. Insuline-injecties kunnen de bloedsuikerhuishouding echter niet volledig herstellen, wat vaak gepaard gaat met nierfalen, oogproblemen en vasculaire complicaties. De gemiddelde levensverwachting van mensen met type 1 diabetes ligt ongeveer 15 jaar lager dan die van de bevolking in zijn geheel.
Een alternatief voor insuline injecties is het transplanteren van insuline producerende cellen. Het is mogelijk om de gehele pancreas te transplanteren voor volledig herstel van de regulatie van de bloedsuikerspiegel. Een nadeel is dat pancreastransplantatie een ingrijpende operatie is, die risico¡¯s voor de patiënt met zich meebrengt, waaronder trombose en lekkage van spijsverteringssappen vanuit de pancreas. Het is ook mogelijk om alleen de eilandjes van Langerhans te transplanteren. De pancreas bevat 1 tot 2 miljoen eilandjes van Langerhans die bij elkaar minder dan 2% van het totale volume van de pancreas in beslag nemen. Dit geringe volume heeft als voordeel dat de transplantatie slechts een bescheiden ingreep is met minimaal risico voor de patiënt. De isolatieprocedure voorafgaand aan implantatie is echter gecompliceerd en pas sinds een aantal jaren effectief genoeg om transplantatie van eilandjes van Langerhans met succes bij patiënten toe te passen. Een groot probleem is de geringe opbrengst van eilandjes van Langerhans na isolatie. Daardoor zijn er minstens twee pancreata nodig om voldoende eilandjes te verkrijgen voor één transplantatie. Aangezien er wereldwijd een groot tekort aan donoren is, is het belangrijk om de oorzaken van deze lage opbrengst nader te onderzoeken.
In dit proefschrift wordt nader ingegaan op het voorkómen van schade aan de eilandjes van Langerhans tijdens en na de isolatieprocedure. Het onderzoek is gestart door eerst de schade en overleving van levercellen (hepatocyten) te bestuderen. Hepatocyten en eilandjes van Langerhans hebben namelijk gemeen dat zij beide tijdens de isolatieprocedure worden gescheiden van hun naaste omgeving. De cellen worden geïsoleerd met collagenase, een enzym dat bindweefsel oplost en zo de cellen van hun omgeving losweekt. Normaal gesproken zijn deze cellen in vivo omgeven door extracellulaire matrix (ECM) eiwitten en worden zij door middel van integrines met elkaar verbonden. Het is bekend, dat de hechting van cellen aan ECM-eiwitten belangrijk is voor hun overleving. Tijdens isolatie van hepatocyten en eilandjes van Langerhans worden deze verbindingen verbroken, wat desastreuze gevolgen voor de cellen kan hebben. Wij hebben onderzocht of het toevoegen van ECM-eiwitten aan geïsoleerde hepatocyten en eilandjes van Langerhans de overleving van deze cellen zou kunnen verbeteren.
Hoofdstuk 2 beschrijft het effect van ECM-eiwitten op de overleving van hepatocyten na isolatie. Er is gekeken naar de mate van apoptose. Dit is een vorm van celdood, die onder andere wordt veroorzaakt als cellen niet meer gehecht zijn aan hun ECM-eiwitten. Wanneer hepatocyten worden gekweekt op de ECM-eiwitten collageen IV en fibronectine, ontstaat minder apoptose dan wanneer de cellen worden gekweekt op collageen I. Collageen I wordt in grote mate geproduceerd tijdens fibrose in de lever en induceert apoptose van hepatocyten. Dit betekent, dat de originele compositie van de lever van belangrijke invloed is op de overleving van donor hepatocyten na transplantatie. Fibrose van de lever in de ontvanger is daardoor een contra-indicatie voor hepatocyten transplantatie. Dit zal wel kunnen worden toegepast bij levers waar de ECM-compositie onaangetast is, zoals bij metabole leverziektes. Daarnaast blijkt uit deze resultaten dat scheiding van hepatocyten van hun ECM apoptose tot gevolg heeft. Daarom zouden deze hepatocyten zo snel mogelijk na isolatie weer herenigd moeten worden met hun eigen ECM-eiwitten voor een beter succes na transplantatie.
In hoofdstuk 3 onderzochten wij het effect van anti-©¬1 integrine antilichamen en RGD peptiden op de overleving van hepatocyten. Het ©¬1 integrine, dat voorkomt op hepatocyten, is het belangrijkste integrine voor de hechting aan ECM eiwitten. RGD is een peptide van 3 aminozuren dat voorkomt in een aantal ECM eiwitten. Behandeling van geïsoleerde hepatocyten met anti-©¬1 integrine antilichamen en RGD peptiden laat een beschermend effect zien. De hepatocyten vertonen een verhoogde expressie van het overlevings-eiwit gefosforyliseerd Akt Ser 473 en een verlaagde expressie van het apoptose-eiwit caspase 3. Tevens hebben wij laten zien dat integrin-linked kinase (ILK) wordt geactiveerd na toevoegen van anti-©¬1 integrine antilichamen en RGD peptiden. Deze behandeling van hepatocyten resulteerde in een verminderde mate van apoptose. Het gebruik van peptiden, zoals RGD peptiden, zou de overleving van donor hepatocyten na transplantatie drastisch kunnen verbeteren.
In hoofdstuk 4 wordt een nieuwe methode besproken om eilandjes van Langerhans te isoleren. Normaal gesproken worden de eilandjes van Langerhans na de behandeling met collagenase d.m.v. dichtheidsgradient centrifugatie gescheiden van de overige delen van de pancreas. Het gebruik van centrifugatie beschadigt de beta cellen in zo'n mate dat ze eerder dood gaan. De nieuwe eilandjesisolatie methode is gebaseerd op een oude methode waarbij glomeruli, kluwens van kleine bloedvaatjes in de nieren, worden geïsoleerd. De nieren worden doorgespoeld met kristallen ijzeroxide en deze ijzeroxide deeltjes lopen vast in de kleinste vaatjes, waarna je de glomeruli met een magneet uit de suspensie kunt trekken. Aangezien de architectuur van de bloedvaatjes van eilandjes van Langerhans gelijkenis vertoont met die van de glomeruli, konden wij deze methode toepassen om eilandjes te isoleren. Hierbij wordt de pancreas met ijzeroxide kristallen geperfundeerd en na behandeling met collagenase kunnen de eilandjes m.b.v. een magneet eenvoudig uit het celmengsel onttrokken worden. Behalve dat deze methode bijzonder snel is, bleek de opbrengst van de eilandjes hoger te zijn dan bij andere isolatie methodes. Tevens waren de eilandjes nog steeds in staat om voldoende insuline te produceren en na transplantatie de diabetes van de ontvanger te genezen. De magnetische retractiemethode is tot nu toe toegepast voor de isolatie van eilandjes van Langerhans uit de pancreas van ratten. In de toekomst zal worden gekeken of deze methode ook toepasbaar is om humane eilandjes te isoleren en of het mogelijk is minder donoren te gebruiken per transplantatie.
In hoofdstuk 5 laten wij het effect van anti-©¬1 integrine antilichamen en RGD peptiden op de overleving van eilandjes van Langerhans zien. Eerst werd gekeken op welke ECM-eiwitten de eilandjes het beste overleefden na isolatie. Dit bleken collageen IV en laminine te zijn. Deze ECM-eiwitten zijn in de pancreas volop aanwezig. Behandeling van de eilandjes met anti-©¬1 antilichamen en RGD peptiden resulteerde in minder apoptose vergeleken met eilandjes die niet behandeld waren. Aangezien eilandjes van Langerhans uit een klompje van cellen bestaan is het opmerkelijk dat antilichamen en peptiden die alleen kunnen hechten aan de buitenkant van het eilandje voor overleving van de binnenste cellen, de beta cellen, kunnen zorgen. Het zou kunnen dat de cellen aan de buitenkant, die zich prettiger voelen na behandeling met de antilichamen en de peptiden, een overlevingssignaal aan hun naburige cellen geven. Hoe dit proces precies werkt, zal nog nader onderzocht moeten worden. Wij hebben laten zien dat RGD peptiden apoptose kunnen voorkómen in zowel hepatocyten als eilandjes van Langerhans. In lymfocyten wordt precies het tegenovergestelde aangetoond: behandeling met RGD peptiden veroorzaakt juist apoptose. Hepatocyten en eilandjes van Langerhans zijn cellen die in vivo gebonden zijn aan ECM-eiwitten. Dit is niet het geval bij lymfocyten die vrij in het lichaam voorkomen. Met andere woorden, het celtype bepaalt of een behandeling met RGD peptiden celdood zal voorkomen. Voor transplantatie doeleinden zou behandeling met RGD peptiden zeer toepasbaar zijn: de getransplanteerde cellen worden beschermd en de lymfocyten, die voor afstoting kunnen zorgen, worden geëlimineerd.
Het transplanteren van eilandjes van Langerhans is slechts voor een select aantal diabetespatiënten toepasbaar. De meeste patiënten zullen hun leven lang insuline moeten spuiten. Helaas gaat dit vaak gepaard met fluctuaties in de bloedglucose concentratie hetgeen kan leiden tot diabetische complicaties, waaronder diabetische nefropathie. Diabetische nefropathie wordt gezien als de grootste oorzaak van chronisch nierfalen. In hoofdstuk 6 wordt de pathogenese van nodulaire glomerulosclerose in transgene muizen die apoC1 tot overexpressie brengen besproken. Nodulaire glomerulosclerose is een vorm van schade aan de glomeruli in de nier, die vaak voorkomt bij diabetespatiënten. Wat ook vaak bij diabetespatiënten wordt gezien is een verhoogde waarde van het apoC1 lipo-proteïne in het bloed. Om de correlatie tussen verhoogde waardes van apoC1 en het ontstaan van nodulaire glomerulosclerose nader te onderzoeken, hebben wij een muis-model gekozen. In de betreffende muizen is de expressie van het apoC1 gen verhoogd. Deze muizen ontwikkelden nodulaire glomerulosclerose met accumulatie van de ECM-eiwitten fibronectine en collageen I, III, IV en VI in de glomeruli. Dit fenomeen is ook vaak te zien in de glomeruli van de nieren van diabetespatiënten. De muizen zijn echter niet hyperglycemisch en hebben geen proteïnurie. Met deze studie hebben wij aangetoond dat nodulaire glomerulosclerose kan voorkomen zonder verhoogde suikerspiegels. Wellicht zijn andere factoren verantwoordelijk voor het ontstaan van nodulaire glomerulosclerose, zoals verhoogde concentraties van het apoC1 lipo-proteïne in het bloed. Hoe de verhoging van apoC1 kan leiden tot de vorming van deze glomerulaire lesies is niet duidelijk. Wel hebben wij in deze studie aangetoond dat zich rondom de glomeruli macrofagen (ontstekingscellen) bevinden. Deze cellen zijn bekend vanwege hun productie van cytokines, zoals TGF-©¬1, dat weer een belangrijke stimulator is van ECM-eiwitproductie door glomerulaire cellen.
A+ A-
Om de letters groter of kleiner te maken houdt u de controltoets ingedrukt en drukt dan op + of -
